La coagulación sanguínea es un fenómeno complejo, transitorio, ordenado y regulado por el sistema de coagulación. Mantiene en equilibrio a los sistemas hemostático y fibrinolítico, es decir, en el primero permite la formación de un coágulo en donde ha ocurrido una lesión vascular para detener la pérdida hemática y en el segundo degrada al coágulo cuando la hemostasia ha cumplido su objetivo.¹

Durante años, la hemostasia se clasificó en primaria y secundaria debido a que se asumía que la activación de las plaquetas y los factores de coagulación ocurría en momentos diferentes; hoy sabemos que ambas respuestas biológicas son simultáneas y están estrechamente relacionadas.² No obstante, esta clasificación continúa vigente para los laboratorios de coagulación, es decir, el estudio de la hemostasia en el laboratorio emplea pruebas globales o especializadas que evalúan de manera independiente la hemostasia primaria y secundaria.

Aunque pareciera sencillo, la selección, desarrollo e interpretación de las pruebas hemostáticas continúan siendo un reto para los laboratorios de coagulación en el país. Ello se debe a que por sí mismo el sistema de coagulación es sumamente complejo, y, por ende, difícil de comprender. Por lo tanto, un elemento crucial para garantizar resultados satisfactorios en el laboratorio recae en qué tanto sabe el químico acerca del tema.

Desde luego, es menester recordar que los errores por ignorancia existen³, y que sus consecuencias pueden ser tan perjudiciales como informar el resultado de una prueba hemostática que no aprobó previamente el control de calidad. Asimismo, debemos enfatizar que la falta de infraestructura de la mayoría de los laboratorios del país limita considerablemente la posibilidad de realizar diagnósticos especializados en pacientes con alteraciones del sistema de coagulación. Si a todo ello sumamos el divorcio inútil entre el profesional de laboratorio y el clínico, el problema se agudiza aún más.

Sería ideal que el profesional del laboratorio informara al médico acerca de la disponibilidad de las pruebas hemostáticas, de la importancia de usar el plasma testigo, del empleo de los ensayos de mezclas, del uso correcto de las pruebas coagulométricas y cromogénicas, de las ventajas y desventajas del uso de productos biológicos de origen humano y bovino, de los aspectos preanalíticos de las pruebas de laboratorio, de las interferencias en las pruebas diagnósticas, del uso de cocientes, del alcance diagnóstico de las pruebas, de los nuevos ensayos de laboratorio, entre otros temas que no pueden pasar desapercibidos y, aunque parezcan ajenos al laboratorio, no lo son.

Tal es el caso de los nuevos tratamientos en hemofilia A y B que consisten en el empleo de moléculas modificadas de los factores VIII y IX con propiedades farmacocinéticas mejoradas o el uso de anticuerpos humanizados que mimetizan la actividad del factor VIII (FVIII) u otras moléculas que afectan la expresión o la actividad de algunos anticoagulantes naturales, como la antitrombina y el inhibidor de la vía del factor tisular.⁴ Esta estrategia elegante de engañar al sistema de coagulación para restablecer la hemostasia en los pacientes con hemofilia implica que las pruebas de laboratorio de antaño requieran ser ajustadas o en su defecto ser sustituidas.

Con relación a la hemostasia primaria, la historia es muy diferente, ya que simplemente no la hay. Durante décadas, el diagnóstico por laboratorio de las trombocitopatías ha pasado desapercibido en nuestro país, en parte por la falta de infraestructura de los laboratorios, pero, en gran medida, porque las pruebas globales que evaluaban la hemostasia primaria han quedado en desuso, como el tiempo de hemorragia (TH) y la prueba de retracción del coágulo (RC).

Por lo tanto, el objetivo de este trabajo fue, sobre la base de la evidencia internacional y la experiencia del grupo de trabajo en México, emitir una serie de recomendaciones acordes con la realidad nacional en relación con las pruebas básicas y especiales que se practican en el laboratorio de coagulación.

Ante este panorama sombrío que vive el laboratorio de coagulación, se realizó un consenso de expertos mexicanos en el diagnóstico por laboratorio de las coagulopatías hemorrágicas, pero no se abordó lo referente a la trombosis. Se dio prioridad a temas elementales que benefician a la mayoría de los laboratorios del país y al diagnóstico de las trombocitopatías y enfermedad de von Willebrand (EVW). Asimismo, se atendió la utilidad del plasma testigo en el laboratorio de coagulación. Con la misma intención se abordó un tema que genera controversia en muchos químicos y clínicos en el país, el uso de diluciones de los plasmas problema y testigo para el diagnóstico temprano de los inhibidores. Por último, el consenso centró su atención en el valor diagnóstico de la agregometría plaquetaria de transmisión de luz y de la citometría de flujo.

El consenso estuvo a cargo de profesionales de laboratorio, investigadores del área y hematólogos con experiencia en el área. Antes de la reunión se eligió una serie de artículos y capítulos de libro torales en el campo del laboratorio de coagulación para que fueran revisados por el panel de expertos. Los artículos fueron elegidos por área de discusión, por ejemplo, hemostasia primaria, secundaria, fibrinólisis, pruebas de rutina, pruebas especiales, entre otras.

La reunión se desarrolló en dos etapas; en la primera se utilizó un escrutinio basado en una prueba Delphi, la cual se aplicó a todos los participantes y consistió en un cuestionario de 50 preguntas. Los participantes contestaron de manera individual y confidencial esta serie de preguntas relacionadas con temas de discusión en el laboratorio de coagulación; las respuestas se registraron en una base de datos para obtener el porcentaje de similitud y diferencia de cada una de las respuestas. La información se compartió durante la reunión, pero se mantuvo en anonimato de quién provenían las respuestas.

Con las bases de datos de las respuestas ya establecidas, los expertos se agruparon en mesas de discusión en una segunda etapa para abordar temas relacionados con las pruebas de escrutinio y las especiales que se realizan en el laboratorio de coagulación. Tras una discusión de tres horas, se establecieron los acuerdos preliminares por cada mesa de trabajo; cada una de estas últimas presentó sus conclusiones al pleno para que éste aceptara o no o bien sugiriera cambios en el concepto emitido. No se emitieron los textos de acuerdo finales hasta llegar a un consenso completo entre todo el grupo.

Las pruebas de escrutinio (o pruebas globales) son las que de manera inespecífica informan sobre el funcionamiento o estado de los componentes de la hemostasia primaria y secundaria. Las más conocidas y empleadas en los laboratorios de coagulación son los tiempos de coagulación (tiempo de protrombina [TP], tiempo de tromboplastina parcial activada [TTPa] y tiempo de trombina [TT]), los cuales evalúan conjuntamente la actividad de los factores de la vía intrínseca, extrínseca y común y los cuales coinciden paralelamente con la teoría antigua de las cascadas de coagulación.^5,6

Con una frecuencia mucho menor, el laboratorio de coagulación realiza pruebas de escrutinio para el estudio de la hemostasia primaria. El TH es una prueba in vivo que se practica directamente en el paciente. Estrictamente, debería ser la prueba que evalúa de manera más cercana la hemostasia porque es una medida natural de la formación del coágulo. Sin embargo, esta prueba está casi en desuso.

El tiempo de oclusión (TO) es la prueba de escrutinio que en cierta medida sustituyó al TH, una prueba ex vivo que simula el proceso de la hemostasia primaria.

El TO emplea sangre anticoagulada con citrato de sodio y cartuchos recubiertos con colágeno y difosfato de adenosina (ADP, adenosine diphosphate) o colágeno y epinefrina para simular la superficie de un vaso dañado. El equipo aspira la sangre contenida en un tubo de recolección a una fuerza de rozamiento de 5,000-6,000/s y la pasa a través de un tubo capilar sobre la membrana de los cartuchos recubiertos con los agonistas, los cuales tienen un orificio de 150 μm de diámetro. Cuando las plaquetas comienzan a activarse, se adhieren, agregan y cierran lentamente el orificio hasta que ocurre la oclusión total y se registra el tiempo requerido para la oclusión.⁷ Finalmente, la prueba de RC —una prueba de escrutinio ex vivo que antes se empleaba para el diagnóstico y clasificación de la trombastenia de Glanzmann— ha quedado en desuso.

En las siguientes líneas se emite una serie de recomendaciones sobre temas de discusión frecuentes en el gremio del laboratorio de coagulación.

Recomendación 1

El TP y el TTPa son pruebas de escrutinio que deben realizarse de manera rutinaria en los laboratorios de coagulación para el diagnóstico de las coagulopatías. El TP informa de la actividad de los factores de la vía extrínseca (FVII) y común (FX, FV, FII y fibrinógeno) en presencia de factor tisular. Por su parte, el TTPa evalúa la función de los factores de la vía intrínseca (FXII, FXI, FIX y FVIII) y común.⁸ El TT es otra prueba de escrutinio que evalúa la conversión del fibrinógeno en fibrina.

A diferencia del TP y TTPa, el TT no se realiza rutinariamente en los laboratorios debido a que las deficiencias cuantitativas y cualitativas del fibrinógeno son muy raras en el ser humano, de la misma manera que los inhibidores no farmacológicos de la trombina.⁹

Por lo tanto, el TT deberá realizarse sólo cuando el médico específicamente lo solicite. La figura 1A muestra un esquema de las vías hemostáticas secundarias (cascadas de coagulación) y de las pruebas que evalúan las vías extrínseca, intrínseca y común.

Recomendación 2

Los resultados de los tiempos de coagulación (TP, TTPa y TT) se interpretan a partir de los valores de referencia que se establecen con la población de estudio de cada laboratorio y deben informarse en segundos.

Los valores de referencia se establecen a partir de medidas de tendencia central (media) y dispersión (desviación estándar) si la distribución de los resultados es normal, pero si es anormal, se deben emplear medias de posición como son los percentiles para definir el valor mínimo y máximo del intervalo de referencia. No deben utilizarse como primera opción los valores de referencia que sugieren los insertos de los reactivos ya que éstos se obtuvieron en otras poblaciones.

Debido a que existe evidencia que muestra que la distribución de los tiempos de coagulación es anormal en la población mexicana¹⁰, recomendamos calcular los valores de referencia con una cantidad considerable de donadores de acuerdo con lo establecido en el documento C28-A2 del Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI), el cual sugiere determinar los valores de referencia con las muestras de 120 individuos.¹¹ Los valores de referencia de los tiempos de coagulación deben determinarse cada vez que los laboratorios cambien el lote de los reactivos, la marca de los reactivos y cuando las pruebas se realicen en otros equipos.

Recomendación 3

Los resultados de los tiempos de coagulación del plasma testigo deben informarse de manera complementaria a los valores de referencia de las pruebas o en caso de que el laboratorio desconozca estos valores.

El plasma testigo debe prepararse con las muestras de donadores aparentemente sanos, que tengan entre 20 y 50 años, y que no consuman fármacos que puedan afectar la determinación de las pruebas en el laboratorio de coagulación.¹²

El objetivo de la creación del plasma testigo es que en él la actividad de los factores de coagulación sea normal, la cual será, para la mayoría de los factores, igual o mayor a 1 UI/ml. Sugerimos que los resultados de los tiempos de coagulación del plasma testigo se determinen en cada corrida e idealmente, más de una vez por día.

Si el plasma testigo se prepara diariamente será suficiente mezclar el plasma de cuatro o cinco donadores pero, si éste va a preservarse en congelación (idealmente a -70°C), recomendamos mezclar al menos los plasmas de 20 donadores.¹²

En ambos casos, ya sea fresco o congelado, el laboratorio deberá tener en cuenta el antecedente de que la mezcla resultante contenga los factores hemostáticos en 100% de actividad o cercana a ésta.¹³

Cada laboratorio debe establecer a partir de cuantos segundos el resultado del TP, TTPa y TT de un plasma problema se considera prolongado, respecto al plasma testigo, ya que estos valores serán diferentes para las distintas marcas y sensibilidades de los reactivos disponibles en la actualidad. Sin embargo, recomendamos considerar que los resultados de los tiempos de coagulación están prolongados si: TP ≥3.0 s; TTPa ≥ 5.0 - 7.0 s y TT ≥2.0 s.

Los pacientes con sintomatología hemorrágica a causa de una hemofilia leve por deficiencia del FVIII o FIX, o de otros factores hemostáticos (incluidos los pacientes con deficiencia del factor de von Willebrand -FVW-), pueden presentar resultados normales del TTPa. Por ello, recomendamos que los laboratorios de coagulación especializados en México, que atiendan a esta población específica, estrechen su valor de corte 1 s para incrementar la sensibilidad de la prueba, con lo cual disminuye la posibilidad de subdiagnóstico de los pacientes.

Recomendación 4

Todo laboratorio de coagulación, ya sea de rutina o especializado, debe disponer de plasma testigo. Su empleo en los ensayos de mezclas o correcciones es indispensable para el diagnóstico de las deficiencias de los factores hemostáticos y de sus inhibidores (Figura 1B).^14,15

Es decir, si después de mezclar el plasma de un paciente con un TTPa prolongado con una parte igual de plasma testigo, el tiempo de coagulación tiende a normalizarse, ello sugiere deficiencia de un factor de coagulación.

Por el contrario, si el tiempo de coagulación se mantiene anormalmente prolongado, entonces se pone en evidencia la presencia de un inhibidor que inactiva a uno o varios factores y que interfiere con la prueba in vitro.

Debe tomarse en cuenta que el éxito del ensayo de mezcla dependerá directamente de la calidad del plasma testigo.

En otras palabras, si el plasma testigo contiene 100% de actividad de los factores hemostáticos o una muy cercana a este valor, entonces, al mezclarse con un volumen igual de un plasma deficiente de un factor de la coagulación tendrá como resultado un valor normal del tiempo de coagulación.

Sin embargo, si el plasma testigo contiene factores hemostáticos por debajo de la actividad esperada, se corre el riesgo de que el plasma testigo no logre compensar la deficiencia del plasma en estudio y, en consecuencia, el resultado del tiempo de coagulación se mantenga falsamente prolongado, lo cual ocasionará que el laboratorio y el clínico sospechen de un inhibidor cuando se trata de una deficiencia de factor.

Pero, si el plasma testigo contiene factores de coagulación con una actividad mucho mayor a la esperada, es posible que se enmascare la presencia de un inhibidor débil en la muestra de un paciente, por lo que el resultado se interpretaría erróneamente como una deficiencia de factor.

Con relación al número de mezclas o correcciones a emplear ante un tiempo de coagulación prolongado, los laboratorios deberían interpretar adecuadamente los resultados para no generar resultados falsos negativos o positivos sobre la presencia de inhibidores.

Si la primera corrección (1:2) normaliza el tiempo de coagulación del plasma problema, el resultado sugiere la deficiencia de un factor de coagulación, por lo que no deberían realizarse más ensayos (correcciones 1:4 y 1:8).

Si la corrección 1:2 del tiempo de coagulación prolongado no tiende a normalizarse, el resultado sugiere la presencia de un inhibidor.

Por lo tanto, en caso de realizarse, las correcciones 1:4 y 1:8 informarán de la potencia del inhibidor; es decir, un resultado prolongado de estos ensayos pone en evidencia que el inhibidor es fuerte; en cambio, si el tiempo de coagulación tiende a normalizarse, se interpreta que el inhibidor es débil.

Las tablas 1 y 2 muestran ejemplos de la utilidad de los ensayos de mezclas (correcciones).

Recomendación 5

Aunque el ensayo de mezclas se interpreta de más de una manera, recomendamos hacerlo comparando el resultado del tiempo de coagulación de la corrección 1:2 vs. el valor superior del intervalo de referencia de la prueba o vs. el valor del plasma testigo.

Normalmente, para la corrección 1:2 del TTPa, la diferencia es ≤5 s respecto al plasma testigo, pero cada laboratorio deberá establecer el valor de corte considerando las diferentes marcas de reactivos y las distintas sensibilidades de éstos.

Idealmente, el valor de corte deberá establecerse empleando muestras de pacientes con deficiencia de algún factor hemostático y de pacientes con inhibidores de interferencia e inhibidores neutralizantes. Para las correcciones 1:4 y 1:8 también se deberán establecer los valores de corte.

Recomendación 6

Los laboratorios pueden incluir las diluciones del plasma testigo (diluciones 1:2, 1:4 y 1:8) y del plasma problema (diluciones 1:2, 1:4 y 1:8) mediante el empleo de solución salina o un amortiguador diluyente de factor para el análisis global y diferencial de los inhibidores de interferencia y de inactivación (Figura 1C).¹⁶

Las diluciones se realizan cuando el ensayo de mezclas sugiere la presencia de un inhibidor. Si después de diluir un plasma con sospecha de inhibidores, el tiempo de coagulación tiende a normalizarse (con relación a las diluciones del plasma testigo), se confirma la presencia de un inhibidor de interferencia.

Por el contrario, si después de realizar las diluciones del plasma problema, el tiempo de coagulación continúa anormalmente prolongado (respecto a las diluciones del plasma testigo), se trata de un inhibidor de inactivación.

La evidencia muestra que las diluciones del plasma problema y plasma testigo se han realizado en los laboratorios de coagulación en México desde hace 50 años¹⁷; sin embargo, su utilidad para evidenciar el comportamiento de los inhibidores en el escrutinio es una práctica reciente, que en casos muy específicos podría evitar que el laboratorio de coagulación realice rutinariamente la prueba de paralelismo al dosificarse la actividad de un factor. La tabla 3 muestra los resultados de las pruebas de correcciones y diluciones en plasmas de pacientes con sospecha de inhibidores.

Recomendación 7

El TH no es una prueba de rutina sino de escrutinio en el diagnóstico de las trombocitopatías. Es el tiempo que tardan las plaquetas en detener la salida de sangre luego de hacer un corte estándar en la piel, de cierta profundidad y longitud, mientras se mantienen condiciones de presión controlada (40 mmHg).¹⁸

Por lo tanto, los resultados de esta prueba sólo serán confiables si se utilizan dispositivos automatizados estandarizados y sólo si se practica por profesionales de laboratorio capacitados para ejecutar correctamente el método de Ivy.

El TH se debe realizar cuando la prueba que mide el TO ex vivo en los equipos PFA-100 o PFA-200 no está disponible y se desea evaluar la hemostasia primaria. Se descarta el TH que se realiza en el lóbulo de la oreja y las que empleen lancetas o agujas en lugar de los dispositivos estandarizados.

Recomendación 8

El TO debe ser la primera opción para el análisis global de la hemostasia primaria en el laboratorio porque es una prueba menos invasiva que el TH, automatizada, que emplea sangre total y de fácil ejecución. Recomendamos realizar esta prueba en primer lugar porque no requiere de personal altamente capacitado.¹⁸

Recomendación 9

En el caso especial del diagnóstico de la trombastenia de Glanzmann (TG), sugerimos emplear la prueba de RC para evaluar globalmente la función plaquetaria debido a que se requiere del complejo receptor GPIIb/IIIa en las plaquetas para desencadenar las señales que activan la RC.¹⁹

La prueba de RC es fácil de estandarizar por los laboratorios y su costo no es elevado. Si el coágulo se retrae al adicionar sangre total anticoagulada a un tubo de vidrio, el suero resultante se cuantifica. En plaquetas normales, los resultados para la RC superan el 40%.¹² La figura 2 muestra el fundamento de las pruebas TH, TO y RC.

Dosificación de factores de coagulación

El laboratorio determina la actividad de los factores de coagulación cuando los resultados del TP, TTPa y/o TT de un paciente con historia clínica hemorrágica están prolongados.

El objetivo es determinar cuál es el factor deficiente para establecer un diagnóstico e, incluso dependiendo del nivel de actividad del factor deficiente, clasificar la enfermedad. Por ejemplo, si el laboratorio concluye que la prolongación del TTPa en un paciente con antecedentes hemorrágicos se debe a la deficiencia del FVIII, el diagnóstico es hemofilia A, pero si la actividad del factor es menor de 1%, entonces, la enfermedad es grave.

El laboratorio de coagulación cuenta con dos métodos para determinar la actividad de los factores, el que se basa en determinar el tiempo de coagulación y el que se basa en la generación de color. El primero corresponde al método coagulométrico. En éste, el laboratorio construye curvas de calibración a partir de un plasma del cual se conoce la actividad de todos los factores de coagulación.

El plasma de calibración se diluye y en cada dilución se determina el tiempo de coagulación (TP o TTPa). A la dilución 1:10 del plasma de calibración se le asigna el valor de 100% de actividad, 50% a la dilución 1:20, 25% a la dilución 1:40 y así sucesivamente.

Con los resultados se construye la curva de calibración entre el tiempo de coagulación y la actividad del factor, normalmente en escala doble logarítmica. De esta manera, para calcular la actividad de un factor en una muestra en estudio se interpola el tiempo de coagulación en la curva de calibración.

El segundo método corresponde al cromogénico, el cual emplea un sustrato cromogénico que consiste en un péptido de cadena corta acoplado a un colorante. Mientras dicho sustrato no sea escindido por un factor de coagulación, la muestra en estudio se mantiene incolora. De esta manera, el método cromogénico emplea la liberación de una sustancia coloreada como punto final para determinar la actividad del factor de coagulación.

Por citar un ejemplo, la actividad del FVIII por el método cromogénico se determina, en una primera etapa, cuando el plasma en estudio se mezcla con FX y FIXa purificados, lo que permite la activación del primero. Así, la cantidad de FXa es proporcional a la actividad del FVIII en el plasma. En una segunda etapa, se adiciona el sustrato cromogénico del FXa y la actividad del FXa se evalúa mediante el monitoreo fotométrico del sustrato cromogénico escindido.²⁰

Ahora bien, tras una breve explicación de ambos métodos ¿cuál de los dos se debe emplear en los laboratorios de coagulación? Para contestar esta pregunta emitimos las recomendaciones que aparecen abajo, pero antes, es necesario comentar brevemente acerca de las pruebas que evalúan los dos factores clave de la etapa final de la hemostasia secundaria, el fibrinógeno y el FXIII.

Es imperativo que el laboratorio de coagulación tenga siempre presente que la deficiencia del fibrinógeno afecta de manera global a la hemostasia al actuar como puente fisiológico en la agregación plaquetaria (hemostasia primaria) y como sustrato de la trombina en la hemostasia secundaria.

El método de Clauss continúa siendo el mejor para determinar la concentración del fibrinógeno. Como este método se basa en el TT, los defectos funcionales del fibrinógeno se reflejarán en la concentración de la proteína. Es decir, el método informa sobre la cantidad y calidad del fibrinógeno.

El procedimiento es similar al descrito para los factores evaluados con el TP y TTPa. Primero se debe construir una curva de calibración a partir del conocimiento de la concentración de fibrinógeno de un plasma de calibración y del TT para cada punto de la curva. El siguiente paso será interpolar los resultados del TT de la muestra en estudio en la curva de calibración para conocer la concentración de fibrinógeno.^8,12

El FXIII (también llamado factor estabilizador de la fibrina) es fundamental en la fase final de la hemostasia porque forma enlaces covalentes entre los monómeros de fibrina, lo que da estabilidad al coágulo.²¹

La deficiencia congénita o adquirida del FXIII es difícil de identificar. Las pruebas actuales para diagnosticarla incluyen la prueba de solubilidad del coágulo, pruebas que miden su actividad, su concentración plasmática, y ensayos genéticos. Sin embargo, los laboratorios comúnmente emplean la prueba de solubilidad del coágulo, que evalúa la estabilidad de un coágulo de fibrina midiendo el tiempo que tarda en degradarse en un medio desnaturalizante. Esta prueba es semicuantitativa, sencilla de realizar y de costo muy bajo.²²

Actualmente, se dispone de otras pruebas que cuantifican la concentración del FXIII, como las cromogénicas. En ellas, el FXIII en el plasma problema se activa en presencia de trombina y calcio. La fibrina generada por efecto de la trombina acelera la reacción, mientras que un péptido inhibidor de la polimerización evita la formación del coágulo.

La actividad del FXIII se pone de manifiesto en presencia de un sustrato sintético (cromogénico) y el éster etílico de glicina, que producen NH₄. El NH₄ es evaluado mediante la reacción de glutamato deshidrogenasa, el cual convierte el NAD-(P)H en NADP en presencia de NH₄ y α-cetoglutarato. La conversión de NAD-(P)H en NADP se detecta a 340 nm, lo cual es directamente proporcional a la concentración de FXIII en el plasma.²³ Una vez explicados de manera sencilla y breve los métodos para estudiar la actividad de los factores de coagulación se emiten las siguientes recomendaciones.

Recomendación 10

En pacientes con TTPa prolongado, el ensayo coagulométrico de un paso debe ser la primera opción para dosificar la actividad del FVIII y de los otros factores de la vía intrínseca, y el TP alargado para evaluar la actividad de los factores de la vía común y el factor VII.

La actividad del factor se determina de manera basal en el plasma problema y diluciones seriadas del mismo (al menos 3) para evidenciar el efecto de los inhibidores de interferencia.¹²Es decir, si al graficar la actividad del factor en estudio en la muestra basal y sus diluciones se observa una línea paralela a la actividad del factor de la curva de calibración, se trata de una deficiencia o inhibición real del factor de coagulación, pero, si las líneas se acercan o se cruzan entre sí, se pone en evidencia la presencia de un inhibidor de interferencia. Coloquialmente, a ello se le denomina prueba de paralelismo o simplemente paralelismo. A pesar de su utilidad, recomendamos realizar el paralelismo sólo cuando el escrutinio de laboratorio no incluyó el uso de las diluciones del plasma testigo y plasma del paciente en las pruebas de TP y/o TTPa.

Recomendación 11

Recomendamos emplear el ensayo cromogénico de dos pasos para evaluar la actividad del FVIII en las siguientes situaciones:

1. En muestras de pacientes con sintomatología hemorrágica y sospecha de hemofilia A moderada debido a que la prueba coagulométrica de un paso puede revelar una actividad del FVIII más elevada que con la prueba cromogénica como consecuencia de mutaciones específicas del gen F8; ello puede resultar en un subdiagnóstico de la enfermedad.^20,24
2. Inhibidores del FVIII ≤2.0 unidades Bethesda/ml (UB/mL), a partir del ensayo coagulométrico de un paso. Algunos estudios sugieren que la prueba cromogénica reduce el número de resultados falsos positivos para los inhibidores del FVIII.^25,26
3. En pacientes en quienes coexisten inhibidores del FVIII e inhibidor lúpico (IL).²⁵ La utilidad de la prueba cromogénica en el diagnóstico del IL se explica en el siguiente apartado.

Recomendación 12

La prueba de solubilidad del coágulo no es una prueba de rutina sino de escrutinio para el diagnóstico de la deficiencia del FXIII. No obstante, la prueba no es sensible a las deficiencias leves y moderadas del FXIII²² ni informa de la concentración real de la proteína porque es una prueba semicuantitativa.

Además, esta prueba está limitada por la falta de estandarización entre laboratorios y por factores adicionales que afectan su sensibilidad, entre éstos, la concentración de fibrinógeno, los reactivos empleados, el agente desnaturalizante y su concentración, así como los tiempos de incubación empleados en la prueba.²²

Por lo tanto, recomendamos realizar pruebas cromogénicas que evalúen la actividad del factor. Sugerimos realizar esta prueba cuando las pruebas de hemostasia primaria y secundaria son normales en un paciente con sintomatología hemorrágica.

Recomendación 13

La concentración del fibrinógeno se debe determinar en plasma de pacientes con TT prolongado y sintomatología hemorrágica, en quienes se ha excluido la presencia de inhibidores de la trombina y productos de degradación del fibrinógeno-fibrina. Recomendamos emplear el método de Clauss que informa acerca de la deficiencia cuantitativa o cualitativa del fibrinógeno.¹⁴

Las pruebas antigénicas (como las basadas en ensayos de ELISA) determinan únicamente la concentración plasmática del fibrinógeno. Por ello, el uso combinado del método de Clauss y del conocimiento de la concentración antigénica del fibrinógeno informa del tipo de alteración de la proteína (cuantitativa o cualitativa). Los laboratorios que no dispongan de las pruebas anteriores pueden derivar la concentración del fibrinógeno a partir del resultado del TP.

Combinar el método de Clauss con el resultado del fibrinógeno derivado del TP mejora la eficiencia del análisis de escrutinio de la disfibrinogenemia congénita porque el cociente fibrinógeno derivado/fibrinógeno de Clauss tiene una alta sensibilidad y especificidad por el trastorno funcional²⁷; pero otros autores informan lo contrario.²⁸

Debido a que esta prueba no cuantifica el fibrinógeno, se debe descartar previamente que la prolongación del TP no sea consecuencia de la deficiencia congénita o adquirida del FVII o de algún factor de la vía común. La utilidad de este cálculo en el laboratorio y en la práctica médica está en función del conocimiento de las limitaciones que conlleva. De hecho, instancias internacionales, como la Sociedad Británica de Hematología, recomiendan en su guía para los ensayos de fibrinógeno, no utilizar esta prueba de manera rutinaria.²⁹

En esta sección nos enfocamos específicamente en el estudio de dos tipos de inhibidores, que directamente interrumpen la actividad de los factores de coagulación, principalmente el FVIII y los que interfieren con la evaluación in vitro de la coagulación, a excepción de los inhibidores farmacológicos.

Los inhibidores del FVIII son muy importantes para el laboratorio y para el clínico porque representan la principal complicación del tratamiento de la hemofilia A. La frecuencia de los inhibidores del FVIII es de 20 a 33% en los pacientes con hemofilia A grave y de 3 a 13% en pacientes con hemofilia A leve o moderada.³⁰ Dichos inhibidores se cuantifican en UB donde 1 UB/ml de inhibidores es capaz de inhibir 50% de la actividad del FVIII en la muestra.³¹

El mecanismo de acción de estos inhibidores incluye impedir estéricamente la unión del FVIII con otros factores hemostáticos, inhibir la activación del FVIII por la trombina o inhibir la liberación del FVIII del complejo VWF-FVIII. Además, los inhibidores del FVIII inhiben la coagulación al ejercer actividad proteolítica sobre el FVIII.³⁰

Independientemente de cuál sea el mecanismo de acción, la inhibición del FVIII se reflejará en la prolongación del TTPa y en la actividad del factor. Sin embargo, la prolongación del TTPa puede no estar asociada con la inhibición del FVIII u otro factor de coagulación. En estos casos será siempre importante descartar la presencia del IL que, aunque es un autoanticuerpo asociado con eventos trombóticos, también puede ocasionar problemas hemorrágicos en los pacientes.

El IL (o anticoagulante lúpico) es uno de los tres criterios de laboratorio para la identificación del síndrome de anticuerpos antifosfolípido (SAAF). Su detección se basa en pruebas de coagulación dependientes de fosfolípidos. El IL es el principal factor que explica las manifestaciones clínicas relacionadas con el SAAF.³²

Aunque el diagnóstico del IL en el laboratorio de coagulación requiere de una metodología particular, el escrutinio de laboratorio suele ser muy importante. Como se mencionó líneas antes, tanto los inhibidores del FVIII como el IL prolongan el TTPa.

Entonces, ¿cómo diferenciar entre ambos inhibidores? En primer lugar, durante el escrutinio de laboratorio se debe evidenciar el efecto de un inhibidor. Para ello se realizan los ensayos de mezcla o correcciones como ya se informó previamente; hasta este punto aún es difícil discernir entre ambos inhibidores. Sin embargo, la dilución seriada de la muestra en estudio puede informar acerca del comportamiento del inhibidor y así, de manera temprana, orientar el diagnóstico ya sea para la búsqueda de inhibidores del FVIII o del IL.

En ambos casos, el diagnóstico de los inhibidores requiere de pruebas específicas, entre ellas el rastreo de los inhibidores del FVIII mediante la incubación del plasma a 37°C durante 2 horas para incrementar la actividad del inhibidor y evidenciarlo de mejor manera con un TTPa. Como estándar de oro para cuantificar el inhibidor, el laboratorio dispone del ensayo Nijmegen-Bethesda³³ (Figura 3).

Este ensayo comprende dos modificaciones al método original descrito en 1975.³⁴ La primera consiste en amortiguar el plasma normal obtenido de una mezcla de plasmas de donadores. La segunda consistió en mezclar el plasma normal amortiguado con plasma deficiente de FVIII, el cual a su vez funciona como diluyente del plasma en estudio cuando el título del inhibidor es alto.

En 2012 se validó una propuesta previa a este ensayo, en la cual la muestra del paciente se somete a una pre-incubación a 56°C por 30 minutos para inactivar el FVIII.³⁵ Con esta estrategia se garantiza que, en el ensayo Nijmegen-Bethesda, el plasma del paciente proporcione los inhibidores del FVIII, mientras que el plasma normal sea la fuente del FVIII.

A la mezcla resultante entre el plasma normal y el plasma del paciente se incuba a 37°C por 2 horas para luego determinar la actividad del FVIII. Lo mismo debe realizarse en una mezcla control (plasma deficiente de FVIII + plasma normal). Con la actividad del FVIII de la mezcla problema y mezcla control se determina la actividad residual del FVIII que será interpolada en una gráfica de calibración para el cálculo de la UB/ml del inhibidor. La tabla 4 muestra ejemplos del cálculo de las UB/mL en pacientes con inhibidores del FVIII.

En relación con el IL, el diagnóstico se realiza siguiendo una serie de pasos y recomendaciones internacionales, como las emitidas por la Sociedad Internacional de Hemostasia y Trombosis (ISTH). Básicamente, se siguen tres pasos³²:

1. Demostrar la prolongación del tiempo de coagulación dependiente de fosfolípidos.
2. Evidenciar la presencia del inhibidor en el ensayo de mezclas.
3. Probar el vínculo del inhibidor por los fosfolípidos.

Considerando que el IL es un inhibidor principalmente relacionado con eventos trombóticos, no se abordará con mayor profundidad el tema. Sin embargo, el químico debe tener presente la posibilidad de la coexistencia de los inhibidores del FVIII y del IL en algunos pacientes, por lo tanto, incluimos algunas recomendaciones al respecto.

Recomendación 14

Los ensayos de mezclas o correcciones con plasma testigo representan el primer paso en la búsqueda de inhibidores. Independientemente de la estrategia que se elija para su interpretación, cada laboratorio deberá establecer sus valores de cohorte. Las recomendaciones 3, 4 y 5 informan más al respecto.

Recomendación 15

Las diluciones del plasma en estudio y plasma testigo se realizan únicamente si los resultados de las correcciones sugieren la presencia de un inhibidor.

En hemofilia adquirida, su empleo permite distinguir tempranamente entre autoanticuerpos del FVIII e IL.

En el primer caso, la diferencia del TTPa del plasma en estudio respecto al plasma testigo será proporcional a la dilución empleada; en cambio, en los pacientes con IL se observa acortamiento en los tiempos de coagulación entre ambos plasmas.¹⁶ Es importante resaltar que el hecho de que el TTPa no esté prolongado en un paciente con sospecha de IL no es un criterio de exclusión del inhibidor.

Aunque lo anterior pareciera absurdo, existe esta posibilidad, la cual tiene una explicación muy sencilla: los reactivos para determinar el TTPa en la rutina son sensibles a la deficiencia del FVIII y otros factores de la vía intrínseca, pero no a los inhibidores de interferencia. En consecuencia, la presencia de IL de baja potencia se enmascara por la concentración de fosfolípidos en los reactivos de TTPa de rutina (leer también la recomendación 6).

Recomendación 16

Los ensayos de mezclas a 37°C durante 2 horas (rastreo de inhibidores) se realizan para demostrar la presencia de inhibidores del FVIII, los cuales tienen la característica de ser dependientes del tiempo y la temperatura; ningún otro inhibidor de los factores hemostáticos presenta este comportamiento.³³ Sin embargo, recomendamos realizar la prueba sólo si el efecto del inhibidor no es evidente en los ensayos de mezclas convencionales. Por tanto, estos ensayos no deben considerarse de rutina en la búsqueda de los inhibidores del FVIII. En caso de realizarse el rastreo de los inhibidores del FVIII, recomendamos a los laboratorios incluir un control negativo (plasma deficiente de FVIII) y uno positivo (plasma con inhibidores del FVIII) durante la prueba.

Recomendación 17

La cuantificación de los inhibidores debe realizarse con el ensayo Nijmegen-Bethesda en plasma de pacientes con FVIII <1UI/dl³³ (Figura 3).

Se debe evitar usar plasma normal de control de calidad en lugar de un plasma normal obtenido de mezclar plasmas de donadores (plasma testigo). Recomendamos determinar la actividad del FVIII en el plasma testigo para tener la certeza de que la actividad es la esperada.

Si la muestra del paciente requiere de una preincubación antes de realizarse el ensayo Nijmegen-Bethesda, recomendamos realizar el mismo procedimiento para el plasma deficiente de FVIII que será empleado en la mezcla control.

Recomendamos preincubar los plasmas en estudio a 56°C por 30 minutos para que la actividad del FVIII sea ˂1%. No recomendamos incubar los plasmas a 58°C por 90 minutos ya que los inhibidores del FVIII se afectan en estas condiciones.³³

Recomendación 18

En pacientes con IL y sospecha de hemofilia adquirida (autoanticuerpos contra FVIII), la actividad del FVIII se debe determinar con una prueba cromogénica ya que, en ésta, el plasma en estudio se diluye más veces que al usar una prueba coagulométrica de un paso, lo cual disminuye la concentración del inhibidor.

Además, el uso de factores purificados activados ofrecidos por el fabricante de la prueba limita la dependencia de estos factores por los fosfolípidos para su activación.^24,25 Por el contrario, si el objetivo es evidenciar el IL en pacientes con inhibidores del FVIII, la prueba de elección para demostrar la actividad del inhibidor sobre el tiempo de coagulación dependiente de fosfolípidos será el tiempo de la víbora de Russel diluido (dRVVT) y no un TTPa a bajas concentraciones de fosfolípidos.

El veneno de víbora empleado en el dRVVT activa al FX en FXa dejando atrás la participación del FVII y de los factores de la vía intrínseca (VIII, IX, XI y XII), así como de sus inhibidores.³⁶ Por lo tanto, los inhibidores del FVIII no tienen ninguna repercusión en los resultados del dRVVT.

Es la prueba estándar de oro para el análisis de la función plaquetaria (Figura 4).^37,38 La prueba detecta defectos funcionales de las plaquetas, pero también es útil para estudiar alteraciones del factor von Willebrand (FVW).

Existen diferentes métodos para evaluar la agregación de las plaquetas: óptico, impedancia, luminiscencia y el flujo de calcio ionizado. De éstos, el óptico es el más utilizado en los laboratorios de coagulación. La prueba mide (en tiempo real) la agregación de las plaquetas en un equipo especializado llamado agregómetro, en el cual se introduce la cubeta de incubación con plasma rico en plaquetas (PRP) del paciente. La cubeta se encuentra ubicada entre una fuente de luz y una fotocelda de medición que calcula la densidad óptica o turbidez de la muestra. La preparación del PRP requiere la separación de los eritrocitos y leucocitos del plasma para que únicamente se analice la función de las plaquetas. También se requiere la preparación de una muestra de plasma pobre en plaquetas (PPP).

Antes de realizar la prueba se debe calibrar la trasmisión de la luz a través de la muestra haciendo uso del PPP del paciente, en el cual, la transmitancia es 100%; la transmisión de la luz a través del PRP se ajusta a 0%.

La agregación plaquetaria se induce al adicionar uno de los varios agonistas plaquetarios en concentraciones estandarizadas.³⁸Entre éstos, la ristocetina (que no es un agonista endógeno) promueve la interacción entre el FVW y la GPIb de las plaquetas, lo cual aporta información valiosa al diagnóstico de la EVW y las trombocitopatías.

La transmisión de la luz se mide en tiempo real mediante un software que construye una gráfica donde se aprecian algunas fases características de la agregación de las plaquetas.

La interpretación de los resultados es muy sencilla: a mayor transmisión de luz a través de la muestra, mayor será el porcentaje de agregación plaquetaria. Cada laboratorio debe establecer valores de referencia para su población de estudio, además de considerar las recomendaciones que a continuación se enlistan.

Recomendación 19

Los ensayos de agregación plaquetaria para el diagnóstico de las coagulopatías hemorrágicas deben realizase mediante la evaluación de la respuesta de las plaquetas ante diferentes agonistas, incluidos los presentes en la circulación, tales como la trombina y la epinefrina; a los agonistas liberados de los gránulos plaquetarios como el ADP y a los agonistas sintetizados por las plaquetas, como el tromboxano A₂ sintetizado a partir del ácido araquidónico.

Además, se incluye al colágeno como un agonista de la matriz extracelular y al antibiótico ristocetina para evaluar la interacción entre el FVW del plasma y la integrina Ibα de las plaquetas.³⁹ Para cada agonista, los laboratorios deben estandarizar su concentración y observar el patrón de resultados esperados. Los laboratorios deberán consultar las recomendaciones internacionales en relación con la concentración de los agonistas como punto de partida durante la estandarización de la técnica.^38,40

Recomendación 20

El ensayo de agregación plaquetaria se realiza empleando 200 x10³ a 300 x10³ plaquetas por μl de plasma. En el caso particular de la trombina, los ensayos de agregación se realizan en plaquetas lavadas, para el resto de los agonistas se emplea PRP.

Las muestras sanguíneas se centrifugan a 800 G por 10 minutos para obtener el PRP. El plasma se diluye 1:2 con amortiguador CGS-EDTA (citrato de sodio 10 mM, dextrosa 30 mM, NaCl 120 mM, EDTA 5 mM, pH 6.5) y se centrifuga a 800 G por 15 minutos. El sobrenadante se decanta y el botón de plaquetas se suspende en 3.0 mL de amortiguador CGS (citrato de sodio 10 mM, dextrosa 30 mM, NaCl 120 mM, pH 6.5). Las plaquetas se centrifugan a 800 G por 12 minutos, se decanta el sobrenadante y el botón de plaquetas se suspende en amortiguador de fosfatos (NaCl 137 mM, KCl 2.7 mM, Na2HPO4 8.1 mM, KH2PO4 1.5 mM, pH 7.4) en un volumen igual al PRP obtenido de la muestra.⁴¹ Adicionalmente, la trombina puede sustituirse por un péptido activador del receptor de la trombina⁴⁰; si éste se usa, no es necesario lavar a las plaquetas.

Recomendación 21

Los laboratorios deberán obtener curvas características de cada agonista en el ensayo de agregación plaquetaria.

Para el ADP, se espera observar dos ondas de agregación. La primera en respuesta al efecto directo del agonista y una segunda por la liberación de ADP de los gránulos plaquetarios y la síntesis de tromboxano A₂.

Para la epinefrina, el patrón de agregación es similar al del ADP, es decir, también se observan dos ondas. Con el colágeno, no se observan dos ondas de agregación. Generalmente, la respuesta a este agonista se caracteriza por una fase de demora previa al inicio de la agregación y por la intensidad de esta última. Al igual que el ADP, el colágeno induce un incremento sutil de la densidad óptica antes de la agregación plaquetaria causado por el cambio de forma.

Con el ácido araquidónico, los gráficos de agregación son monofásicos y la agregación de las plaquetas está precedida una breve fase de demora.

La ristocetina no es un agonista plaquetario, pero facilita la interacción de las plaquetas con el FVW a través de la integrina Ibα. En respuesta al FVW, se observan dos ondas de agregación plaquetaria durante el ensayo, la primera por acción del factor en las plaquetas (que será proporcional a la concentración y actividad del FVW en el plasma), y la segunda es resultado de la liberación de sustancias endógenas de las plaquetas en respuesta a su activación.³⁹

Recomendación 22

La agregación plaquetaria con ristocetina debe emplearse en el diagnóstico del síndrome de Bernard Soulier (SBS), TG y EVW.

En el SBS, la agregación plaquetaria con ristocetina es baja o ausente, en contraste con los demás agonistas plaquetarios que muestran respuestas normales.⁴² Esto se debe a que en este síndrome las plaquetas tiene una expresión deficiente de la GPIb^42,43, pero normal para el complejo receptor GPIIb/IIIa.

En la TG, la agregación plaquetaria con ristocetina es normal o ligeramente disminuida porque la activación de las plaquetas por el FVW involucra también la activación del complejo receptor αIIbβ3. Pero, la agregación plaquetaria con los otros agonistas es muy baja o ausente.⁴⁴

En la EVW, el empleo de la ristocetina en los ensayos de agregación está dirigido exclusivamente al diagnóstico diferencial entre los subtipos 2A y 2B. Los pacientes con EVW tipo 2B tienden a mantener la agregación de las plaquetas aún si se utilizan concentraciones decrecientes de ristocetina.⁴⁵

La citometría de flujo es quizás la prueba más empleada en investigación en Inmunología y en la Oncohematología. Tiene numerosas ventajas, incluidas la evaluación individual del grado de activación plaquetaria, la detección de subpoblaciones plaquetarias y la evaluación cuantitativa de biomarcadores, en comparación con otros métodos que requieren del aislamiento previo de las plaquetas del plasma. No obstante, sus desventajas son el costo elevado, la dificultad para estandarizar la prueba, obtener valores de referencia, así como la dependencia del observador.⁴⁶

Para discriminar poblaciones de células se pueden utilizar parámetros como la dispersión directa (FSC) para determinar el tamaño y la dispersión lateral (SSC) para determinar la granularidad. Las características únicas de las plaquetas hacen que la citometría de flujo sea perfectamente adecuada para su identificación. La detección de la expresión ausente o reducida de las glicoproteínas es el objetivo principal de esta técnica para el análisis de plaquetas.⁴⁶

En el laboratorio de coagulación, su utilidad se centra en el estudio de las trombocitopatías como el SBS y la TG, aunque también es útil para analizar los estados protrombóticos. En el SBS, el receptor plaquetario deficiente es el complejo GPIb/IXa/V.⁴² Por lo tanto, este síndrome se diagnóstica por el uso de los anticuerpos anti-CD42a (GPIX) y anti-CD42b (GPIb).⁴⁷

En la TG, el receptor deficiente en cantidad o calidad es la GPIIb/IIIa, lo cual puede ser detectado por los anticuerpos monoclonales anti-CD41 y anti-CD61, respectivamente.⁴⁸ Además, el empleo del anticuerpo PAC-1, que reconoce el sitio de unión del fibrinógeno en la GPIIb/IIIa, informa de manera específica sobre defectos funcionales de este receptor plaquetario. A pesar de las bondades de la citometría de flujo se emiten las siguientes recomendaciones.

Recomendación 23

Para este análisis, recomendamos emplear plaquetas lavadas a partir de PRP.⁴⁹ De esta manera, los análisis se hacen a partir de una muestra purificada de plaquetas y se evita la formación de geles y agregados que afectan la inmunotipificación. La adquisición de los eventos en el citómetro de flujo deberá estandarizarse en cada laboratorio, al igual que la concentración de los anticuerpos conjugados con los fluorocromos para la identificación de las proteínas de interés.⁴⁹

Recomendación 24

Pese a lo publicado en la literatura⁴⁹, para los ensayos de citometría en los que se requiera activar las plaquetas recomendamos usar calcio como primera opción debido a que es un agonista fuerte de las plaquetas, económicamente accesible para todos los laboratorios y el cual se requiere en concentraciones muy bajas. La trombina también se emplea para este propósito, pero debe emplearse en concentraciones muy bajas para evitar que la agregación de las plaquetas afecte los resultados del análisis, además, el costo de la trombina es más elevado, en comparación con el calcio.

Recomendación 25

El laboratorio debe tener presente que la citometría de flujo y la agregometría plaquetaria son pruebas complementarias en el diagnóstico de las trombocitopatías, por lo que ninguna sustituye a la otra.⁴⁹ La explicación es sencilla: la información que arrojan las pruebas es diferente.

Indiscutiblemente, con la citometría de flujo no se puede estimar el porcentaje de agregación plaquetaria, pero sí informa las causas de una agregación deficiente de las plaquetas. La citometría de flujo permite identificar defectos cuantitativos y cualitativos en las plaquetas mediante el uso de anticuerpos en contra de epítopos expresados de manera constitutiva e inducible. Además, permite estudiar las plaquetas de pacientes con trombocitopenia, a diferencia de la agregometría plaquetaria.⁵⁰

La citometría también tiene la capacidad de evaluar grandes cantidades de eventos en un lapso corto de tiempo. Asimismo, permite evaluar la degranulación de las plaquetas y las deficiencias plaquetarias caracterizadas por la disminución o ausencia en la cantidad y contenido de los gránulos alfa y densos⁵⁰, algo que la agregometría plaquetaria de impedancia eléctrica evaluada en sangre total sólo puede hacer en los gránulos densos mediante la evaluación de la liberación de ATP.⁵¹

Por lo tanto, no queda duda de que la citometría de flujo es capaz de detectar alteraciones plaquetarias, incluso sin el uso de marcas fluorescentes, únicamente mediante el empleo de los perfiles de tamaño y complejidad.

Recomendación 26

Para el diagnóstico y clasificación de la TG, el laboratorio deberá demostrar que la agregación plaquetaria es deficiente y que la expresión del receptor GPIIb/IIIa está disminuida o que el receptor es disfuncional.³⁹

Debido a que el tipo III de la TG es un defecto funcional de GPIIb/IIIa con expresión proteica normal —y aunado a que el anticuerpo PAC-1 (platelet activation complex-1) reconoce una región específica en la GPIIb/IIIa activada⁵², con la cual se une a sus ligandos—, el anticuerpo tiene la capacidad de diferenciar entre los defectos cuantitativos (tipos I y II) y el defecto cualitativo (tipo III) del receptor GPIIb/IIIa.⁵³

Recomendación 27

El diagnóstico de las trombocitopatías debe informarse tanto en porcentaje de plaquetas que expresan las proteínas en estudio como en unidades arbitrarias de intensidad de fluorescencia mediada (IFM) que informan de la expresión de las proteínas en la membrana de las plaquetas.⁴⁹

Consideramos que informar únicamente los resultados del análisis de citometría en «porcentaje de células» es una práctica incorrecta.

El porcentaje de plaquetas que expresan el receptor GPIIb/IIIa entre una muestra control y la muestra de un paciente con TG puede ser similar, de la misma manera entre pacientes con los tres tipos de la enfermedad, pero la expresión de las proteínas en la membrana de las plaquetas en unidades arbitrarias de IFM sería menor en los pacientes con TG que en los controles.

Entre pacientes con TG, los tipos I tendrían la menor expresión de GPIIb/IIIa, seguido de los tipos II y III. Sin embargo, los pacientes con TG tipo III tendrían la menor expresión de GPIIb/IIIa si se emplea el anticuerpo PAC-1.⁵³ En consecuencia, es fundamental que los laboratorios establezcan intervalos de referencia para la expresión de los receptores plaquetarios.

Los autores declaran que para esta investigación no se han realizado experimentos en seres humanos ni en animales. Respecto de la confidencialidad de los datos, los autores declaran que en este artículo no aparecen datos de pacientes.